生物滯留系統處理水產養殖尾水技術
隨著水產養殖業在全球范圍內的快速發展，水產養殖尾水的產生量也日益增多。由于水產飼料的高氮特征，導致養殖尾水呈高氮低碳的特點。近年來，為改善水環境質量和促進水產養殖業的綠色發展，各地相繼出臺了嚴格的水產養殖尾水地方排放標準，倒逼養殖尾水的有效處理。現階段，常用的養殖尾水處理技術包括人工濕地、生態溝渠、生態浮床和生物濾池等，盡管也取得了良好的處理效果，但均存在著占地面積大、處理效果不穩定等技術問題。因此，尋求穩定、高效的養殖尾水處理技術迫在眉睫。
生物滯留系統(bioretentionsystem，BS)是最佳的雨水管理設施之一，因其成本低且效果好，被廣泛應用于城市雨水徑流污染的治理。目前，有關BS的應用研究主要集中于降雨徑流處理，將其跨行業應用于養殖尾水的處理還鮮有嘗試。由于降雨徑流和養殖尾水在水質特點和排放規律方面具有一定的匹配性，如，兩者水質均呈現出高氮低碳和水量為間歇排放的特點，這使得將BS技術應用于養殖尾水處理具備了可能性。BS的脫氮性能與其填料的組成和構造形式密切相關。如正置的BS技術主要以強致密性的介質土層置于上層，而將較好透氣性的砂質過濾層及碎石排水層置于底層，通過介質的過濾、吸附、微生物作用和植物吸收達到污染物去除的效果，但仍然存在脫氮效率不穩定等問題。LI等為解決上述問題，設計的倒置BS構造則是與正置相反，徑流被上層礫石層存儲并緩慢排出，滯留的水分阻礙了氧氣的擴散，使得下層介質土層創造了更好的缺氧區，NO3?-N去除高于正置的28.6%~53.9%。近年來，國內外對于正置和倒置BS的脫氮效能已有研究，但用于養殖尾水處理的效能尚未可知，且缺乏足夠的證據闡述其背后的作用機理。
胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，EPS)是以蛋白質為主要功能成分的微生物分泌物，其產生可視為微生物個體的粘合劑，是形成生物膜的核心。EPS包含的氧化還原介質對BS的脫氮性能至關重要，如C型細胞色素和腐殖質等。有研究表明，EPS儲存的氧化還原介質在電子傳輸過程中可有效充當電子供體和電子受體(NO3?)之間的傳遞橋梁，這決定了電子穿梭的效率，最終影響反硝化脫氮性能。此外，EPS濃度也是影響微生物反硝化的重要因素，如WANG等研究發現EPS的額外添加提高了系統1.66倍的電子傳遞活性(ETSA)，從而提高了19%~34%的反硝化效率。基于此，解析EPS和電子傳遞活性對于探究BS的脫氮機制意義重大。
為此，本研究設計并構建了正置和倒置2組生物滯留系統，在不同進水條件下探究了其處理水產養殖尾水的運行規律，并通過EPS及電子傳遞活性分析揭示了BS的構建方式對脫氮效能的影響，旨在為應用生物滯留技術處理養殖尾水提供參考。
1、材料與方法
1.1 系統構建
如圖1所示，以直徑為20cm的圓形有機玻璃柱構建了CBS和IBS2組生物滯留系統，CBS自上而下分為20cm蓄水層、30cm介質土層、20cm填料層(0.2~4mm河沙)和10cm排水層(8~23mm碎石)，IBS則相反。每個系統的底部設置有內徑為20mm的穿孔管，通過將排水口抬高至底部排水層上方30cm，形成了一個飽和區域，以增強反硝化的作用。參考WU等的研究，選用根長和根密具有一定優勢的黃菖蒲(IrispseudacorusL)作為供試植物，種植前經過電子秤恒重，以確保2個系統間的生物量誤差不超過1g。土壤取自西南大學蠡園內種植土，攤開曬干后與河沙按7:3的體積比反復混合至均勻后裝填。
1.2 尾水配置
為盡可能接近養殖水的水質特點，本實驗采用研磨魚糞的方法模擬養殖尾水。即，將取來的魚糞曬干研磨，過100目篩得到魚糞粉末。根據前期對重慶市水產養殖尾水的走訪調研和LIU等的研究，論文采取模擬3種污染物負荷濃度梯度進水的方式，以代表池塘養殖和循環養殖尾水(見表1)，同時檢驗CBS和IBS在面臨不同污染物濃度沖擊下的運行效能。每個濃度梯度進行3次實驗，進水方式采用灑水器進水并確保養殖水均勻噴灑至填料表層，每次進水5L使其自然下滲，實驗間隔周期為1d。
1.3 EPS的提取及測定
為確保實驗的準確性，使用等邊三角形法對介質土表層以下15cm和45cm處取樣，其中15cm處使用20mm的空心管進行取樣，45cm處設置有取樣口(見圖1)，等體積混勻后采用陽離子交換樹脂法進行胞外聚合物(EPS)的提取。提取步驟如下：配置1.109g·L?1的CaCl2溶液(Ca(OH)2調節pH=7)，使用該溶液與土樣混勻后在4℃下搖晃30min，5100r·min?1離心后倒掉上清液以剔除易溶性有機物。使用陽離子交換樹脂和Na3PO4·12H2O(0.760g·L?1)、NaH2PO4·H2O(0.552g·L?1)、NaCl(0.526g·L?1)和KCl(0.074g·L?1)的冷凍萃取液進行沉積物的EPS提取，重懸后于4℃下搖晃2h，5850r·min?1離心即得到含EPS的上清液。
PS采用硫酸苯酚法進行測定；PN使用BCA試劑盒法進行測定，即以牛血清蛋白作為標準溶液，在562nm處檢測吸光值，與標準曲線對比后計算出其濃度。
1.4 三維熒光光譜分析
使用熒光分光光度計(F-7000FL，日本日立)的三維熒光光譜檢測，對2種構建方式下的EPS主要成分進行比較分析。將上述EPS提取液過0.45um濾膜后，以蒸餾水為空白在EEM掃描的激發波長(Ex)和發射波長(Em)均為200~550nm、步長為5nm、掃描速度為12000nm·min?1的條件下進行檢測。
1.5 電子傳遞活性(ETSA)的測定
ETSA的測定是基于將2-(對碘苯基)-3-(對硝基苯)-5-苯基四唑氯(INT)還原為甲瓚(INF)的原理，測定方法參考ZHENG等和WAN等的研究結果。取上述土樣10g，用4mLPBS(100mM,pH7.4)洗滌2次后重懸于PBS溶液中，即得到懸浮樣品。接下來將1mg的NADH和1mLINT加入5mL上述提取液中，在黑暗和30℃的條件下培育30min。培育完成后加入1mL甲醛終止反應，10000r·min?1離心5min后到掉上清液，加入5mL甲醇提取甲瓚。最后在波長為490nm處檢測甲瓚的形成，ETSA由式(1)計算得到。
式中：E為ETSA，ug·(g·min)?1；A為波長在490nm處的吸光度；15.9為INT-INF的比吸收率；V0和V1分別為待測樣初始體積和甲醇的體積，mL；t為培育時間，min；32/2為INT-INF轉化為O2的系數；m為蛋白質的質量濃度，mg·mL?1。
1.6 水質分析
NH4+-N和NO3?-N的檢測先經過0.45um濾膜抽濾，再分別使用納氏試劑法和分光光度法進行檢測，TN和TP分別使用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度和鉬酸銨分光光度法進行檢測。后期數據處理和作圖分別使用Excel2016和Origin2018完成，使用SPSS進行顯著性分析。
2、結果與討論
2.1 同間隔周期進水對氮磷去除的影響
1)TN和NO3?-N的去除效果分析。
由圖2(a)~(b)可知，TN和NO3?-N的去除規律一致，在TN和NO3?-N的進水質量濃度分別為18.99~20.90mg·L?1和10.58~14.40mg·L?1的情況下，CBS的平均出水質量濃度分別為(6.60±1.87)mg·L?1、(5.08±1.91)mg·L?1，IBS則分別為(4.45±0.74)mg·L?1、(3.03±0.54)mg·L?1，IBS的TN和NO3?-N平均去除率高出CBS的10.65%、15.89%。養殖尾水中的TN主要包括NO3?-N、NH4+-N和總有機氮(TON)，其去除包括NH4+-N的吸附和硝化、TON的沉降和礦化、NO3?-N的反硝化等，由于NH4+-N和TON的轉化并不能有效脫氮，因此TN的去除主要依賴于微生物的反硝化。反硝化效率低或不穩定一直以來都是BS技術的一大難題，原因在于其條件的難以建立。反硝化的發生依賴于電子的供給和缺氧條件的建立，電子通常是由微生物將碳源降解供給，而缺氧條件卻難以建立。在過去，許多學者通過增加淹沒區深度來提高NO3?-N的去除效率，因為淹沒區的增加可以更好的創造厭氧條件，但這無疑增加了實際工程中的應用成本。相對于CBS，IBS在不增加淹沒區深度的情況下，NO3?-N出水質量濃度更低且穩定，這得益于倒置生物滯留系統將致密性較差的介質土層置于底層，創造了更好的缺氧空間，有利于反硝化的發生。
2)NH4+-N的去除效果分析。
如圖3(a)所示，在NH4+-N的進水質量濃度為2.07~3.45mg·L?1的條件下，CBS和IBS的平均出水質量濃度分別為(0.43±0.09)mg·L?1和(0.50±0.11)mg·L?1，平均去除率為(83.66±4.22)%、(80.42±6.18)%。IBS的NH4+-N平均去除率略低于CBS，但并不具備顯著性(P>0.05)。LI等構建的倒置BS的NH4+-N去除率略低于正置的4.4%。本研究結果與其相似。排入系統的NH4+-N很容易經過介質土層的物理吸附、離子交換和硝化作用得以去除，因此，傳統的生物滯留系統對氨氮有著較強的去除效果。如仇付國等在利用傳統BS技術處理城市降雨徑流的研究中，NH4+-N的去除率在95%以上。然而，本研究與傳統的BS相比，NH4+-N去除率明顯降低。由于水產養殖動物對于飼料的不完全吸收和利用是養殖水體氮污染的主要來源，正如劉興國在氮收支平衡中指出，飼料中僅有20%~25%的有機氮被魚類利用，其余均以糞便及代謝物排入水體。因此，養殖水體中存在大量固態和可溶態有機氮，被截留于系統的有機氮經微生物的氨化作用轉化導致NH4+-N產生增加，從而導致NH4+-N去除受限。此外，實驗干期較短也導致產生的NH4+-N未來得及經過硝化細菌轉化，因此與傳統生物滯留系統相比去除效果較低。
3)TP的去除效果分析。
由圖3(b)可知，盡管TP的進水質量濃度高達4.58~5.14mg·L?1，但CBS和IBS的TP出水質量濃度均保持在較低且穩定的水平，平均出水質量濃度分別為(0.38±0.12)mg·L?1和(0.21±0.09)mg·L?1，平均去除率為(92.15±2.32)%和(95.77±1.85)%。有研究表明，BS技術已經可以實現有效的除磷，且磷去除率均在90%以上。與降雨徑流不同，由于養殖尾水中含有大量未被利用的飼料殘留物和糞便，因此，TP中的顆粒性磷(PP)可能占據主要成分，而PP很容易被BS的填料經過過濾和吸附實現去除。IBS對于TP的去除僅高于CBS的3.62%，并無明顯優勢(P>0.05)，這進一步說明BS對于TP的去除主要是靠介質驅動。CBS和IBS僅是構建方式的不同，其填料組成完全一致，因此，兩者均能對TP實現有效的去除。
2.2 進水濃度對氮磷去除的影響
在低、中和高3種進水質量濃度條件下，分析了CBS和IBS對TN與NO3?-N的去除效果，以檢驗BS應對不同類型養殖尾水的抗沖擊能力，結果如圖4(a)~(b)所示。可見，TN與NO3?-N的去除規律一致，隨著低質量濃度增加至中質量濃度時，其去除率均呈上升趨勢，CBS和IBS的TN去除率分別由(14.06±4.03)%、(40.00±13.31)%增加至(70.46±3.90)%、(78.95±1.29)%，NO3?-N則是由(?4.54±0.63)%、(43.93±11.68)%提高至(61.31±10.70)%、(74.05±5.39)%。ZHANG等以煤矸石為改性填料探究了不同降雨徑流濃度下的運行規律，隨著進水TN濃度的提高，去除率由41.9%提高到了56.1%，研究結果與其相似。相關研究也表明，在該氮質量濃度范圍內可能有利于刺激微生物的快速生長，進而促進了TN的去除。當進水負荷由中濃度至高濃度時，TN和NO3?-N去除率無明顯變化趨勢，說明即便在中濃度和高濃度負荷的沖擊下，CBS和IBS的運行效能均無顯著影響。而IBS對TN和NO3?-N的去除率均高于CBS，其原因在于倒置生物滯留系統將致密性較強的介質土置于底層，有利于維持缺氧條件，促進了微生物的反硝化。由圖4(c)~(d)可知，隨著進水濃度的增加，CBS的NH4+-N去除率由(90.23±2.47)%逐漸降低至(52.18±6.10)%，IBS則是呈現出先略上升后降低的趨勢。而對于TP的去除，CBS和IBS均較穩定，去除率分別為95.25%~98.06%、97.04%~99.22%。養殖尾水中存在大量未被利用的飼料和糞便殘留物，導致了水體中的TON含量較高。隨著進水濃度的升高，排入系統的TON逐漸增加，經礦化作用后NH4+-N有所增加，迫使CBS的去除率逐漸降低。與CBS的構建方式不同，IBS上層的碎石河沙填料空隙較大，因此，有著較強的復氧能力，亞硝化菌和硝化菌在此環境下能夠快速繁殖，促進了NH4+-N的去除，這是IBS有著更穩定的NH4+-N去除的原因。對于TP的去除，其去除機制與氮素不盡相同，TP的去除以介質的吸附為主導。CBS和IBS系統構建形式不同，但裝填填料一致，因此，除磷效果差距不大，并且在不同進水質量濃度下的去除率也無顯著改變。
2.3 構建方式對EPS的含量及主成分的影響
生物滯留系統的EPS含量如圖5所示，IBS的EPS含量顯著高于CBS(P<0.05)，其中CBS和IBS的PS分別為(218.53±16.97)ug·g?1和(285.42±6.84)ug·g?1，PN為(815.95±20.97)ug·g?1、(1419.19±40.75)ug·g?1。2種系統提取的EPS高于REDMILE-GORDON提取的耕地和草原土壤的3~8倍，說明在長期的養殖尾水馴化下，土壤微生物通過分泌更多的EPS來應對環境的變化。有研究表明，微生物分泌的EPS與脫氮性能密切相關。而IBS的EPS含量顯著高于CBS，這可能是IBS脫氮效果優于CBS的原因。一方面，IBS將致密性較強的介質土層置于底層創造了更好的缺氧環境，在該環境下促進了反硝化細菌的快速繁殖并分泌大量EPS來抵御氮素的沖擊。另一方面，IBS較高的EPS含量提高了氮素的轉化能力，這歸結于EPS所儲存的氧化還原活性介質。因為EPS包含的氧化還原介質可以直接作為微生物電子傳遞的媒介。HU等的研究報告中也指出，EPS的增加提高了系統氧化還原活性介質的含量，最終降低了電子傳遞的阻力。而在反硝化過程中，由于NO3?作為電子接收體，因此，電子穿梭能力對硝酸鹽的轉化至關重要。
對已處理的EPS稀釋10倍后進行三維熒光光譜掃描，結果如圖6所示。參考SUN等的研究結果將熒光分為5個區域，分別代表5種不同的有機物成分。由圖6的熒光光譜位置可知，2種構建方式下BS的EPS物質組成大致相同，但熒光強度有明顯的區別。相對于其他區域，代表酪氨酸和色氨酸的區域Ⅰ和區域Ⅱ熒光強度最強，且峰值更明顯。區域Ⅰ和Ⅱ均為芳香類蛋白質，這表明EPS中蛋白質是最主要的物質成分。有研究表明，微生物在應對環境變化做出自我調控的機制中，PN發揮著十分重要的作用。尤其是微生物在面臨氮素的沖擊下，其分泌的PN可作為保護蛋白并提高自身的聚集活性。而在氮循環過程中，PN甚至可作為信號分子調控所要酶的產生、運輸和利用。
區域Ⅲ所代表的為類富里酸，其熒光強度在兩系統中接近，與其他區域相比較為暗淡。類富里酸是是天然水中常見的熒光成分和典型的陸地有機物，可從區域V的類腐殖質中分離出來。當前已有研究表明類腐殖質中有許多氧化還原性官能團，可介導電子穿梭或直接作為微生物厭氧呼吸中的電子受體參與電子轉移。區域Ⅳ為微生物代謝產物，IBS的熒光強度高于對照組。微生物代謝產物由內源性產生，這表明該系統的微生物活性較強，因此在應對環境變化時也能表現出更加靈敏的自我調控能力，這可能是IBS脫氮性能強于對照的原因。
2.4 構建方式對ETSA的影響
對BS的電子傳遞活性(ETSA)進行的分析結果如圖7(b)所示。IBS的ETSA顯著高于CBS，其中IBS和CBS的ETSA分別為(0.47±0.07)ug·(g·min)?1、(0.82±0.16)ug·(g·min)?1。反硝化發生的條件需要具備缺氧環境和電子的供應，其中電子由微生物的碳源代謝產生。如圖7(a)所示，碳源在相關酶的逐步降解過程中產生NADH，生成的NADH被電子傳遞系統(ETS)轉移，在NADH脫氫酶的催化作用下產生電子，最后電子被醌池傳遞給反硝化酶所利用。
綜上所述，ETSA決定了反硝化過程中的電子傳遞效率，這將直接影響NO3?-N的去除。由實驗結果可知，2種BS的構建方式是影響ETSA的主要原因，而ETSA將對系統的脫氮效能產生影響。IBS將介質土層置于底層，反硝化菌在此環境下快速繁殖并產生比CBS更多的EPS。EPS中芳香類蛋白質和腐殖質含有的電化學活性生物分子已被證實可介導電子穿梭，因此，IBS中較高含量的EPS可提高電子傳遞活性，這可能也是IBS脫氮效果優于CBS的原因。此外，在電子傳遞鏈中EPS還可釋放碳源和提高相關酶的活性來增強硝酸鹽的去除。LIU等的研究表明，當EPS發生部分解吸時會釋放碳源并增強反硝化相關酶的活性，以此可提高13.6%的硝酸鹽去除率。由此可知，ETSA與BS的脫氮性能密切相關，而ETSA主要由EPS中的電化學活性生物分子介導，提高ETSA是增強反硝化脫氮的有效途徑。
3、結論
1)IBS和CBS可在不同程度上實現水產養殖尾水的脫氮除磷效果。在運行周期間隔為1d的情況下，IBS的TN和NO3?-N去除率可分別達到71.79%~82.00%和68.70%~85.84%，平均去除率分別高出對照組的10.65%和15.89%。
2)IBS的構建方式抗沖擊能力較強。TN和NO3?-N去除率隨進水負荷的增加呈現先升高后穩定的趨勢，而IBS比CBS的抗沖擊性更強；2種構建方式對TP的去除率則無顯著差異，去除率均可穩定在97.04%~99.22%。
3)構建方式對EPS的組分無明顯影響，但對EPS含量和ETSA影響顯著。IBS的構建方式可通過促進微生物分泌更多的EPS來提高自身的調控能力，其中PS和PN分別高于CBS的66.89ug·g?1、603.24ug·g?1；EPS的主成分相同，但IBS的酪氨酸、色氨酸和微生物代謝產物含量明顯高于對照組；此外，IBS的高PN含量可提高電子傳遞的活性，以此提升該系統的脫氮效能。
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